AVALIAÇÃO DA VIA DE REPARO POR RECOMBINAÇÃO HOMOLOGA EM TUMOR (HRD)

A avaliação de variantes somáticas nos genes BRCA1 e BRCA2 assim como a mensuração do escore de instabilidade genômica permitem a identificação de proficiência ou deficiência na via de reparo por recombinação homóloga, podendo assim direcionar terapia com inibidores de PARP. Nesse teste são avaliadas as seguintes alterações:
- alterações de nucleotídeo único (SNVs)
- pequenas inserções e deleções (INDELs)
- amplificações e perdas gênicas ou de ao menos 1 exon (CNVs)
- Escore de instabilidade genômica - valor calculado com base em algoritmo da Myriad que leva em consideração 3 cicatrizes genômicas - perda de heterozigose (LOH), desbalanço alélico telomérico (TAI) e grandes transições (LST).

Os resultados são acompanhados por um laudo interpretativo, com dados que incluem as variantes identificadas e sua associação terapêutica. 
 

Método: As amostras tumorais fixadas serão avaliadas por médico patologista que fará a seleção da área tumoral representativa. Dez seções de cada tumor serão utilizadas para a extração do DNA. O protocolo segue com um preparo inicial para a fragmentação enzimática das moléculas de DNA e inserção de adaptadores com indexes únicos. A captura e enriquecimento da região-alvo (genes BRCA1 e BRCA2 e escore de instabilidade genômica) é realizada com kit Illumina TSO 500HT+HRD. Após o sequenciamento de nova geração (NGS) das sequências-alvo, utilizando-se a plataforma NovaSeq6000 (illumina), é realizado o alinhamento das sequências e detecção de variantes com base na versão do genoma GRCh37, utilizando pipeline Illumina (versão 3.10) e o escore de instabilidade é realizado por um módulo específico da DRAGEN (Powered by Myriad). O critério mínimo de qualidade do sequenciamento exige profundidade de cobertura maior ou igual a 100X para no mínimo 98% da região alvo. São reportadas as alterações pontuais e pequenas deleções e inserções em regiões com cobertura mínima de 100X e frequência alélica mínima de 2% para SNVs e 5% para Indels (pequenas inserções e deleções). São reportadas alterações de número de cópias (perdas em homozigose ou heterozigose e ganhos de quatro vezes ou mais) de ao menos 1 exon. Variantes detectadas com critérios inferiores ao mínimo estabelecido podem ser reportadas a depender de sua relevância clínica.

Este teste NÃO avalia fusões gênicas, e pode não detectar deleções ou inserções de tamanho intermediário como, por exemplo, inserções do tipo Alu. Os dados do sequenciamento são processados em um pipeline de bioinformática desenvolvido e validado internamente. As variantes identificadas e filtradas nesse pipeline passam por uma anotação gênica que utiliza a inteligência artificial Franklin by GENOOX que classifica as variantes em cinco categorias: patogênica, provavelmente patogênica, significado incerto (VUS), provavelmente benigna, ou benigna. Variantes com classificação provavelmente benigna ou benigna não são reportadas. 

Este teste NÃO faz distinção entre variantes somáticas e variantes germinativas e, portanto, não tem a intenção de fornecer informações sobre a predisposição ao câncer. A classificação de variantes somáticas adotada neste teste não deve ser utilizada, transposta ou interpretada para diagnóstico de doença de origem germinativa. Para variantes encontradas associadas com síndromes de predisposição hereditária ao câncer considerar, a critério clínico, investigação por teste germinativo complementar. Para o escore de instabilidade genômica são avaliados três biomarcadores (perda de heterozigosidade, desequilíbrio alélico telomérico e grandes transições) que indicam a positividade para valores igual ou maior que 42. Os resultados de cada caso são discutidos individualmente por uma equipe multidisciplinar composta por médicos patologistas moleculares, geneticistas e equipe técnico-científica para a confecção do laudo.